Produk

Uji kromatografi cair kinerja tinggi baru untuk glikosiltransferase berdasarkan derivatisasi dengan asam antranilat dan deteksi fluoresensi.

Pengujian dikembangkan menggunakan kimia pelabelan unik asam 2-aminobenzoat (2AA; asam antranilat, AA) untuk mengukur aktivitas β1-4 galaktosiltransferase (GalT-1) dan α2-6 sialyltransferase (ST-6) dengan cairan berkinerja tinggi kromatografi (HPLC) dengan deteksi fluoresensi (Anumula KR. 2006. Kemajuan dalam metode derivatisasi fluoresensi untuk analisis kromatografi cair performa tinggi dari karbohidrat glikoprotein. Anal Biochem. 350:1-23).N-Acetylglucosamine (GlcNAc) dan N-acetyllactosamine digunakan sebagai akseptor dan uridin difosfat (UDP)-galaktosa dan cytidine monophosphate (CMP)-N-acetylneuraminic acid (NANA) masing-masing sebagai donor untuk GalT-1 dan ST-6.Produk enzimatik diberi label in situ dengan AA dan dipisahkan dari substrat pada kolom TSKgel Amide 80 menggunakan kondisi fase normal.Unit enzim ditentukan dari area puncak dengan membandingkan dengan standar turunan secara bersamaan Gal-β1-4GlcNAc dan NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Linearitas (waktu dan konsentrasi enzim), presisi (intra- dan interassay) dan reproduktifitas untuk pengujian ditetapkan.Tes yang ditemukan berguna dalam memantau aktivitas enzim selama isolasi dan pemurnian.Tes tersebut sangat sensitif dan dilakukan sama atau lebih baik daripada pengukuran berbasis gula radioaktif tradisional.Format pengujian juga dapat digunakan untuk mengukur aktivitas transferase lain, asalkan akseptor karbohidrat mengandung ujung pereduksi untuk pelabelan.Pengujian untuk akseptor glikoprotein dikembangkan menggunakan IgG.Metode profiling HPLC singkat dikembangkan untuk pemisahan IgG glycans (duatennary G0, G1, G2, mono- dan disialilasi), yang memfasilitasi penentuan aktivitas GalT-1 dan ST-6 secara cepat.Selain itu, metode pembuatan profil ini terbukti berguna untuk memantau perubahan glikan IgG dalam pengaturan klinis.