Produk

Memahami metabolisme inang mikroba sangat penting untuk pengembangan dan optimalisasi proses biokatalitik berbasis sel utuh, karena menentukan efisiensi produksi.Hal ini terutama berlaku untuk biokatalisis redoks di mana sel-sel yang aktif secara metabolik digunakan karena kapasitas regeneratif kofaktor/kosubstrat endogen dalam inang.Escherichia coli rekombinan digunakan untuk memproduksi prolin-4-hidroksilase (P4H) berlebih, suatu dioksigenase yang mengkatalisasi hidroksilasi L-prolin bebas menjadi trans-4-hidroksi-L-prolin dengan a-ketoglutarat (a-KG) sebagai kosubstrat.Dalam biokatalis sel utuh ini, metabolisme karbon pusat menyediakan kosubstrat a-KG yang diperlukan, menggabungkan kinerja biokatalitik P4H langsung ke metabolisme karbon dan aktivitas metabolisme.Dengan menerapkan alat biologi eksperimental dan komputasional, seperti rekayasa metabolik dan (13) analisis fluks metabolik-C ((13) C-MFA), kami menyelidiki dan mendeskripsikan secara kuantitatif respons fisiologis, metabolik, dan bioenergi dari seluruh biokatalis sel. ke biokonversi yang ditargetkan dan mengidentifikasi kemungkinan hambatan metabolisme untuk rekayasa jalur rasional lebih lanjut. Strain E. coli yang kekurangan degradasi prolin dibangun dengan menghapus gen putA yang mengkode prolin dehidrogenase.Biotransformasi sel utuh dengan strain mutan ini tidak hanya menyebabkan hidroksilasi prolin kuantitatif tetapi juga menggandakan laju pembentukan trans-4-L-hidroksiprolin (hyp) spesifik, dibandingkan dengan tipe liar.Analisis fluks karbon melalui metabolisme sentral dari strain mutan mengungkapkan bahwa peningkatan permintaan a-KG untuk aktivitas P4H tidak meningkatkan fluks pembangkit a-KG, menunjukkan operasi siklus TCA yang diatur secara ketat dalam kondisi yang dipelajari.Pada strain tipe liar, sintesis dan katalisis P4H menyebabkan penurunan hasil biomassa.Menariknya, galur ΔputA juga mengkompensasi kehilangan ATP dan NADH terkait dengan mengurangi kebutuhan energi pemeliharaan pada tingkat penyerapan glukosa yang relatif rendah, alih-alih meningkatkan aktivitas TCA. KO putA pada E. coli BL21 rekombinan (DE3) (pLysS) ditemukan menjanjikan untuk katalisis P4H produktif tidak hanya dalam hal hasil biotransformasi, tetapi juga mengenai tingkat biotransformasi dan serapan prolin dan hasil hip pada sumber energi.Hasilnya menunjukkan bahwa, setelah knockout putA, kopling siklus TCA ke hidroksilasi prolin melalui kosubstrat a-KG menjadi faktor kunci yang membatasi dan target untuk lebih meningkatkan efisiensi biotransformasi yang bergantung pada a-KG.