Produk

Cara penggabungan efek mutasi simultan untuk mengubah aktivitas enzimatik tidak mudah diprediksi karena efek ini tidak selalu aditif secara linier.Oleh karena itu, karakterisasi efek mutasi simultan residu asam amino yang mengikat substrat dapat memberikan kontribusi yang signifikan untuk memahami spesifisitas substrat enzim.Dalam beta-glikosidase dari Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), residu Q39 dan E451 berinteraksi dengan substrat dan ini penting untuk menentukan spesifisitas substrat.Mutan ganda Sfbetagly (A451E39, S451E39 dan S451N39) dibuat dengan mutagenesis terarah-situs, diekspresikan dalam bakteri dan dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas.Enzim tersebut dikarakterisasi menggunakan substrat p-nitrofenil beta-galaktosida dan p-nitrofenil beta-fukosida.Rasio k cat/Km untuk mutan tunggal dan ganda Sfbetagly yang mengandung mutasi terarah-situs pada posisi Q39 dan E451 digunakan untuk menunjukkan bahwa efek pada energi bebas belati ganda ES (kompleks keadaan transisi enzim) dari mutasi ganda (Gdouble daggerxy) bukan jumlah efek yang dihasilkan dari mutasi tunggal (Gdouble daggerx dan Gdouble daggery).Perbedaan dalam belati Gdouble ini menunjukkan bahwa efek dari mutasi tunggal sebagian tumpang tindih.Karenanya, efek umum ini hanya dihitung sekali dalam Gdouble daggerxy.Data kristalografi pada beta-glikosidase mengungkapkan adanya ikatan hidrogen bidentat yang melibatkan residu Q39 dan E451 dan gugus hidroksil yang sama dari substrat.Oleh karena itu, data termodinamika dan kristalografi menunjukkan bahwa residu Q39 dan E451 memberikan pengaruh timbal balik pada interaksi masing-masing dengan substrat.